肿瘤精准诊断 · 行前知识储备
用途：艾德生物拜访（许燕彬 · 技术市场高级总监）｜ 假设：PCR 基础扎实，病理与 NGS 从零讲起 ｜ 2026-10-26
读完这份材料你会得到三样东西：① 能听懂艾德每条产品线在做什么、卡在哪；② 能用对方的语言讨论 MRD、液体活检、NGS 与病理；③ 能把“原料”翻译成“他们的技术问题”，而不是报货号。
导览先建立一张全景图
肿瘤精准诊断的所有技术，本质上都在回答三个问题：样本里有没有肿瘤 DNA/蛋白？是什么变异？丰度多少？ 样本只有两类来源：组织（手术/穿刺/FFPE）和体液（血液为主，即液体活检）。技术只是在这两类样本上做不同的“放大与读出”。
记忆锚点：组织看“形态 + 蛋白 + 基因”，血液看“基因 + 表观”。IHC/FISH 是“在切片上看”，PCR/NGS 是“把 DNA 拿出来看”。
01病理 15 分钟入门（IHC / FISH 是什么）
1.1 一张切片是怎么来的
取样 → 10% 中性福尔马林固定（固定过度会破坏抗原/DNA）→ 脱水 → 石蜡包埋（FFPE）→ 切片 4 μm → 贴片 → 脱蜡 → 染色。病理医生先在 HE 染色上圈出肿瘤区域、评估肿瘤细胞比例，再决定做 IHC 还是 FISH，或送分子检测。
1.2 免疫组化（IHC）：用抗体“点亮”蛋白
原理：抗原（组织里的蛋白）— 一抗（特异性结合）— 二抗（带 HRP 酶）— DAB 底物在酶作用下生成棕色沉淀，沉积在抗原本地；苏木素把细胞核染蓝，形成对比。显微镜下看“棕色的位置与强度”。
- 关键步骤：抗原修复（加热/酶解，暴露被固定掩盖的抗原表位）→ 封闭 → 一抗孵育 → 二抗 → DAB → 复染。
- 判读：不是“阳性/阴性”这么简单，要算比例与强度。
| 指标 | 定义 | 用在哪 | 关键阈值 |
|---|
| TPS（肿瘤比例评分） | 任何强度膜染色的活肿瘤细胞 / 全部活肿瘤细胞 ×100% | NSCLC 的 PD-L1（22C3 抗体） | <1% 阴性；1–49% 低表达；≥50% 高表达 |
| CPS（联合阳性评分） | （肿瘤细胞 + 免疫细胞）PD-L1 阳性细胞数 / 活肿瘤细胞数 ×100 | 胃癌、食管癌、宫颈癌等 | 不同瘤种阈值不同（如胃癌 CPS≥5/≥1） |
| HER2 IHC | 0 / 1+ / 2+ / 3+ 四级 | 乳腺癌、胃癌 | 3+ 阳性；2+ 需 FISH 确认；0/1+ 阴性 |
易错点：不同抗体克隆号（22C3、28-8、SP263、SP142）对应的药物与阈值不同，不能互换判读；IHC 结果依赖前处理与判读经验，是“半定量”。
1.3 FISH：在细胞核里数“基因拷贝”
原理：把荧光标记的 DNA 探针变性后与切片上的目标 DNA 杂交，洗掉未结合探针，DAPI 染核，荧光显微镜下数亮点。双探针法同时数目标基因（如 HER2，红）与染色体着丝粒（CEP17，绿）。
- HER2/CEP17 比值 ≥2.0 且平均 HER2 拷贝数/细胞 ≥4.0 → FISH 阳性；比值 ≥2.0 但拷贝 <4.0 需增加计数再判；比值 <2.0 但拷贝 ≥6.0 也需结合 IHC 判读（详见 2019 版乳腺癌 HER2 检测指南）。
- 信号成簇可直接判阳性；计数至少 20 个浸润癌细胞核。
- FISH 也用于 ALK/ROS1/RET 等融合检测（断裂分离探针）。
一句话区分：IHC 看“蛋白多不多”，FISH 看“基因拷贝多不多/有没有断裂重排”。两者都是原位检测，不破坏组织结构。
02PCR 家族（你的强项，快速对齐到肿瘤场景）
| 方法 | 原理一句话 | 典型检出限（VAF） | 优势 | 局限 |
|---|
| qPCR（荧光定量） | 边扩增边测荧光，Ct 值定量 | 1–5% | 快、便宜、成熟 | 只能已知位点、低丰度易漏 |
| ARMS（突变扩增阻滞） | 引物 3' 端与突变配对，野生型不扩增 | 0.1–1% | 特异度高、单管快速 | 每位点一套引物、多重能力有限 |
| Super-ARMS | ARMS + 更严格引物/探针设计，提高抑制物耐受 | ≈0.1–0.5% | 适合血浆 ctDNA | 仍是已知位点 |
| dPCR（数字 PCR） | 把反应分成上万微滴，逐滴计数 | 0.01–0.1% | 绝对定量、抗抑制 | 通量低、位点数少、成本高 |
| 甲基化 PCR（如 MSI 熔解曲线） | 亚硫酸氢盐转化后扩增，熔解曲线判读 | 依位点而定 | 表观标志、组织友好 | 转化损失、引物设计难 |
与艾德对应：ADx-ARMS / Super-ARMS 是其 PCR 主线（EGFR、KRAS、BRAF、PCR-11 基因等）；2026-05 新批的 MSI 用荧光 PCR 熔解曲线法（国械注准20263401021）。
03NGS 从零讲清（建库 → 测序 → 生信 → 报告）
3.1 一句话理解
NGS 不是“更准的 PCR”，而是把样本里所有 DNA 片段同时读一遍：加接头 → 扩增/捕获 → 上机测序 → 把读到的短序列比对回参考基因组 → 数每个位点上有多少“突变型”和“野生型” reads。突变比例 = VAF（variant allele fraction）。
3.2 两种主流建库路线（决定灵敏度与成本）
| 路线 | 怎么做 | 适合 | 优点 | 缺点 |
|---|
| 杂交捕获（hybrid capture） | 建库后用车针/生物素探针把目标基因“钓”出来，再测序 | 大 panel（几十到几百基因）、融合、CNV | 覆盖广、均一性好、可测融合/内含子 | 流程长、需更多 DNA（常 50–200 ng）、成本高 |
| 多重扩增（amplicon / tNGS） | 用多对引物直接把目标区域扩出来再测 | 中小 panel（10–100 基因）、FFPE、低输入 | 快速、低输入、成本低 | 引物二聚体、覆盖不均、融合检测弱 |
3.3 看懂 NGS 报告要抓的 6 个数字
| 指标 | 含义 | 好坏判断 |
|---|
| 测序深度（×） | 某位点被读到的次数 | 组织 panel 常 ≥500×；血浆 ctDNA 常 ≥3000× |
| 覆盖均一性 | 目标区域是否都被均匀测到 | ≥95% 区域达到目标深度 |
| VAF | 突变 reads / 总 reads | 血浆 0.1% 已属低丰度；组织 5–10% 常见 |
| 检出限 LOD | 能稳定检出的最低 VAF | 普通 panel 0.5–1%；UMI panel 0.1%；MRD 0.01% |
| 肿瘤细胞含量 | 组织样本中肿瘤 DNA 占比 | <20% 时低频突变易漏，需富集或换样本 |
| 假阳性来源 | FFPE 脱氨（C>T）、CHIP、污染 | 看是否做 UDG/修复、是否有配对白细胞 |
3.4 生信不是黑箱：三件事决定结果
- 比对与去重：把 reads 比对到参考基因组；用 UMI 把同一原始分子的 PCR 拷贝归并，去掉扩增错误。
- 变异 calling 与过滤：按深度、VAF、链偏好、重复序列、健康人群数据库过滤；CHIP 相关基因（DNMT3A/TET2/ASXL1）要特别标记。
- 注释：把变异对应到基因、氨基酸改变、药物证据等级（如 OncoKB、NCCN、CSCO）。
关键认知：NGS 的“灵敏度”不是仪器给的，是起始 DNA 量 × 建库效率 × 测序深度 × 去重纠错共同决定的。血浆样本尤其受 cfDNA 投入量限制（常 10–30 ng，约 3,000–10,000 个单倍体基因组）。
04液体活检：ctDNA 到底是什么
4.1 生物学基础
- 细胞凋亡/坏死会释放 DNA 到血液，叫 cfDNA（循环游离 DNA），片段约 90–150 bp。
- 肿瘤来源的那部分叫 ctDNA。它在 cfDNA 中的占比：中晚期约 8–10%；早期或治疗后缓解可低至 0.01–1.7%。
- ctDNA 半衰期 15 分钟至数小时，所以能“实时”反映肿瘤负荷变化。
- 释放受肿瘤负荷、位置、血管化、治疗影响；不是所有肿瘤都释放足够的 ctDNA（脑肿瘤、部分早期肿瘤尤其低）。
4.2 为什么液体活检难做
| 难点 | 具体表现 | 对原料/方法的要求 |
|---|
| 丰度极低 | 0.01–1% 的突变混在 99% 野生型里 | 高灵敏酶、低背景、UMI、深度测序 |
| 起始量少 | 10 mL 血仅得 10–30 ng cfDNA | 低输入建库、少损耗、直扩/单管 |
| 片段短 | 90–150 bp，易降解 | 短片段友好酶、避免过度片段化 |
| 假阳性 | CHIP（克隆性造血）、FFPE 伪影、污染 | 配对白细胞、UDG、双链 UMI |
| 假阴性 | 肿瘤不释放 ctDNA | 不能单靠血液排除，需组织对照 |
CHIP 是什么：随年龄增长，造血干细胞积累突变（DNMT3A、TET2、ASXL1 最常见），这些突变会出现在血液 cfDNA 里，被误判为肿瘤突变。70 岁以上人群检出率可达 10% 量级，是液体活检假阳性的常见原因；tumor-informed（对照肿瘤组织）可显著降低误判。
4.3 检测方法怎么选
| 方法 | 适合场景 | 灵敏度 | 局限 |
|---|
| ARMS / Super-ARMS qPCR | 已知单点位（如 EGFR T790M） | 0.1–0.5% | 位点固定、不能发现新变异 |
| dPCR | 已知点位的绝对定量、疗效监测 | 0.01–0.1% | 位点数少、通量低 |
| 靶向 NGS panel | 多基因、未知位点、融合 | 0.1–1%（UMI 可到 0.05–0.1%） | 成本高、生信复杂 |
| 甲基化 / 多组学 | 早筛、组织溯源 | 依算法 | 验证门槛高、证据仍在积累 |
05MRD：比“复发”更早的信号
5.1 定义与临床价值
MRD（分子残留病灶）指治疗后影像学看不到病灶、但血液里仍能查到肿瘤 DNA。它比影像学提前数月提示复发风险，可用于：术后是否需要辅助治疗、疗程长短、复发监测、临床试验分层。
5.2 两条技术路线（这是和艾德对话的核心）
| tumor-informed（肿瘤知情） | tumor-agnostic（肿瘤不知情） |
|---|
| 怎么做 | 先测患者肿瘤组织（WES），挑出该患者特有的 16–50 个突变，定制探针，再测血浆 | 用固定 panel 直接测血浆，不依赖组织 |
| 灵敏度 | 可达 0.01% VAF（Signatera 等） | 通常 0.1% 量级 |
| 优点 | 背景极低、假阳性少、可个体化追踪 | 无需组织、周转快、成本低 |
| 缺点 | 需组织、需 WES、周期 3–4 周、成本高 | 灵敏度略低，CHIP 干扰更明显 |
| 代表 | Natera Signatera、RaDaR、华大/燃石/世和的 MRD 产品 | 部分固定 panel MRD、甲基化 MRD |
国内 MRD 现状：近 3 年国内近 20 款 MRD 相关产品发布，主流仍是 LDT 服务（燃石、世和、华大、臻和等），注册产品在逐步增加；临床证据集中在结直肠癌、肺癌、乳腺癌。
06行业格局：谁在做哪一段
6.1 全球
| 公司 | 定位 | 代表产品/技术 |
|---|
| Roche | IVD 巨头 + 靶向药伴随诊断 | cobas 平台、组织/血液 CDx |
| Abbott | 全球 IVD 巨头 | m2000、Alinity m |
| Illumina | 测序平台 + 试剂 | TSO 500（组织/血液）、NovaSeq |
| Thermo Fisher | 测序平台 + 试剂 | Oncomine、Ion Torrent |
| QIAGEN | 样本前处理 + PCR | therascreen、cfDNA 提取 |
| Guardant Health | 液体活检纯玩家 | Guardant360、Shield（早筛） |
| Foundation Medicine（Roche） | NGS 大 panel | FoundationOne CDx / Liquid CDx |
| Natera | MRD 龙头 | Signatera（tumor-informed，0.01% LOD） |
6.2 国内
| 公司 | 2025 营收 | 强项 | 与艾德的关系 |
|---|
| 艾德生物 | 11.98 亿（+8.01%） | PCR 伴随诊断证最多、IHC/FISH 齐全、日韩欧出海 | — |
| 世和基因 | 5.77 亿（+16.33%） | NGS 大 panel、LDT 服务转产品 | NGS 端主要竞争者 |
| 燃石医学 | 约 5 亿量级（2024 年 5.16 亿） | NGS、液体活检、MRD | NGS/液体活检竞争者 |
| 华大基因 / 华大智造 | — | 测序平台 + 感染/肿瘤检测 | 平台型竞争者 |
| 臻和、桐树、思路迪 | — | NGS 肿瘤检测、MRD | 细分竞争者 |
| 金域、迪安 | — | ICL 渠道，承接医院外送 | 渠道端，非直接产品竞争 |
口径：2025 年营收来自公司年报/招股书与公开报道；燃石为美股上市公司，2024 年营收 5.158 亿元（同比 -4.0%），2025 年数据以公司披露为准。
6.3 上游原料（我们所在的位置）
| 环节 | 关键原料 | 海外主要供应商 | 国产主要供应商 |
|---|
| PCR / qPCR | Taq HS、dNTP、UNG、buffer | NEB、Thermo、Roche/Kapa | 翌圣、诺唯赞、菲鹏、宝锐 |
| 逆转录 | MMLV RT、RNase Inhibitor | NEB、Thermo | 诺唯赞、翌圣、宝锐 |
| NGS 建库 | 高保真聚合酶、连接酶、UDG、dNTP | NEB、Thermo、Kapa、QIAGEN | 翌圣、诺唯赞、菲鹏（部分） |
| 冻干/常温 | 冻干保护剂、冻干球代工 | — | 宝锐（DG/冻干球）、部分 CDMO |
口径提醒：上游原料的“国产化率”没有统一公开数据；上表只列主要玩家，不代表份额排序。谈份额时不要给数字，除非有具体来源。
07技术对比一页表（背下来就够用）
| 技术 | 检出限 | 通量 | TAT | 样本量 | 最适合 | 原料卡点 |
|---|
| qPCR | 1–5% | 1–5 位点 | 2–3 h | 10–50 ng | 已知热点、快速筛查 | 特异性、抗抑制 |
| ARMS/Super-ARMS | 0.1–1% | 几位点 | 2–3 h | 10–30 ng | 血浆 ctDNA 已知位点 | 引物设计、低背景 |
| dPCR | 0.01–0.1% | 1–6 位点 | 3–4 h | 5–20 ng | 绝对定量、MRD 追踪 | 微滴稳定性、抗抑制 |
| NGS panel | 0.1–1%（UMI 0.05%） | 10–500 基因 | 3–7 天 | 10–200 ng | 未知位点、融合、TMB/MSI/HRD | 建库效率、覆盖均一、UMI |
| tumor-informed MRD | 0.01% | 16–50 位点 | 3–4 周（首检） | 10–30 ng cfDNA | 术后复发监测 | 超低背景、超深度、定制探针 |
| IHC | 半定量 | 1–2 标志/切片 | 1–2 天 | 4 μm 切片 | 蛋白表达（PD-L1/HER2） | 抗体克隆、抗原修复 |
| FISH | 拷贝数/融合 | 1–3 探针 | 1–3 天 | 4 μm 切片 | 扩增/重排（HER2、ALK） | 探针设计、判读经验 |
08把知识接回艾德：他们每条线在做什么
| 艾德产品线 | 用的技术 | 技术卡点 | 我们能接的点 |
|---|
| EGFR / KRAS / BRAF / PCR-11 基因 | ADx-ARMS / Super-ARMS qPCR | 低丰度、抗抑制、多重均一 | FastAmpli 快速酶、低背景 NA 版 |
| MSI（2026-05 新证） | 荧光 PCR 熔解曲线 | 熔解曲线分辨率、批间重复 | 高保真 Taq + 稳定 buffer |
| NGS 10 基因（组织+血液） | ddCapture 杂交捕获 | cfDNA 低输入、UMI、覆盖均一 | 低背景预混、10× 高浓度、冻干 |
| BRCA/HRD、HANDLE 系列 | NGS panel | 复杂变异、同源重组评分 | 高保真建库酶（需确认产品线） |
| PD-L1 / HER-2 IHC | IHC | 抗体克隆、判读一致性 | 非主战场（可谈辅料） |
| ALK/ROS1/RET FISH | FISH | 探针、判读 | 非主战场 |
| MRD（潜在/在研） | tumor-informed 或 fixed panel | 0.01% 灵敏度、CHIP 干扰 | NA 低背景 + UNG + 冻干 |
对话句式：“你们 PCR 线已经是国内最全的，真正的增量在血液版和 MRD。这两块的门槛不在引物设计，在背景——背景每降一个数量级，灵敏度才能上一个台阶。我们最近在 NA 低背景和冻干上做的，就是这件事。”
09术语表（会上听到不慌）
| 术语 | 一句话解释 |
|---|
| FFPE | 福尔马林固定石蜡包埋，病理最常用的样本保存方式；DNA 会片段化并有 C>T 伪影。 |
| cfDNA / ctDNA | 血浆里的游离 DNA / 其中来自肿瘤的部分。 |
| VAF | 突变等位基因频率，突变 reads 占比。 |
| LOD | 检出限，能稳定测到的最低 VAF。 |
| UMI | 分子标签，给每个原始 DNA 分子打标，用于去重纠错。 |
| CHIP | 克隆性造血，老年人血液中常见的非肿瘤突变，液体活检假阳性主因之一。 |
| MRD | 分子残留病灶，治疗后血液中仍可查到的肿瘤 DNA。 |
| tumor-informed | 先测肿瘤组织、定制位点，再测血液。 |
| tumor-agnostic | 固定 panel 直接测血液，不依赖组织。 |
| TPS / CPS | PD-L1 的两种判读评分：肿瘤细胞比例 / 联合阳性评分。 |
| FISH | 荧光原位杂交，数基因拷贝或看断裂重排。 |
| HRD | 同源重组缺陷，PARP 抑制剂疗效标志。 |
| TMB | 肿瘤突变负荷，免疫治疗疗效参考指标。 |
| MSI | 微卫星不稳定，免疫治疗标志之一，也用于林奇综合征筛查。 |
| CDx | 伴随诊断，与特定药物绑定的检测。 |
| LDT | 实验室自建检测，未走注册路径的院内检测。 |
10八个常见误区（避免在会上说错）
- “NGS 比 PCR 灵敏”——不一定。普通 NGS panel 的 LOD 常是 0.5–1%，不如 dPCR；MRD 的 0.01% 是靠 tumor-informed + 超深度 + UMI 做到的，不是 NGS 本身。
- “血液能替代组织”——不能。早期/低释放肿瘤血液可能阴性，组织仍是金标准；血液的优势是动态、可重复。
- “VAF 就是肿瘤细胞比例”——不是。VAF 受肿瘤纯度、拷贝数、杂合性影响。
- “IHC 阳性就是有突变”——不是。IHC 看蛋白表达，突变要看 DNA。
- “FISH 比值 ≥2 就是扩增”——要结合拷贝数，2019 指南分了多种情况，需增加计数。
- “CHIP 很少见”——老年人不少见，是液体活检假阳性的常见来源。
- “冻干只是去掉水”——冻干会改变酶构象与缓冲体系，必须验证冻干前后活性与加速稳定性。
- “国产酶只能做低端”——不能这么说。是否能用取决于批间一致性、文件与验证数据，不是产地。
11会上可用的 10 个问题（显得懂行）
- PCR-11 用的是 ARMS 还是 Super-ARMS？血浆样本的 LOD 做到多少 VAF？
- MSI 熔解曲线法的判读阈值怎么定？批间重复性用什么指标控？
- NGS 10 基因血液版的 cfDNA 投入量是多少？用单端还是双端 UMI？
- MRD 走 tumor-informed 还是固定 panel？如果是 tumor-informed，WES 自己做还是外包？
- 组织与血液结果不一致的样本，你们内部怎么处理？
- FFPE 的 C>T 伪影，你们用 UDG 处理还是生信过滤？
- 出海注册对原料的 TSE/BSE、无动物源、批间一致性有什么硬要求？
- 冻干产品的复溶时间和加速稳定性标准是多少？
- 原料双供的验证批次要求是几批？变更控制走什么流程？
- 对国产酶的批间 CV，你们能接受到什么水平？
五句不要说
- “我们什么都能做。”（会被追问具体数据）
- “某家进口酶不行。”（贬低对手，失分）
- “MRD 我们也能做。”（宝锐不做检测服务，只做原料）
- “0.01% 我们能保证。”（没有数据不要承诺）
- 把“艾德范思（北京）”和“厦门艾德生物”混为一谈。（法人不同，数据不能合并）
来源主要依据
- ctDNA 占 cfDNA 比例与半衰期：福建省药监局科普《循环肿瘤DNA的检测应用介绍》 https://yjj.scjgj.fujian.gov.cn/ztzl/kpzl/kpzs/202204/t20220407_5878335.htm
- ctDNA 高通量测序临床实践专家共识（2022 年版），CAIVD
- Signatera 技术白皮书（LOD 0.01% VAF）：Natera
- 乳腺癌 HER2 检测指南（2019 版），中华病理学杂志
- 非小细胞肺癌 PD-L1 免疫组织化学检测规范中国专家共识（TPS 阈值）
- Illumina 目标富集（杂交捕获）技术页；IDT/Illumina tNGS 资料
- 艾德生物 2025 年年报摘要、2026 年半年报；NMPA 2026 年批准信息
- 世和基因招股书/公开报道（2025 营收 5.77 亿）；燃石医学公开财报（2024 营收 5.158 亿）
- 液体活检多癌种筛查专家共识（2025 版）等综述
说明：本文用于内部行前准备，技术参数为行业通用范围，具体产品性能以厂家说明书与实测数据为准；市场份额类数字仅引用公开披露，未披露处不估算。
