# 封闭文献获取清单（需付费 / 馆际互借 / 作者索取）

> 生成 2026-09-12（终版，数字由脚本计算）｜**口径：Unpaywall 实测无合法开放版，且 Europe PMC / PMC 均无全文的文献，才进本表**
> 价格量级未经逐一核实，下单前以出版社站内实时价为准。**盗版镜像/破解渠道一律不使用。**

## 一、判定依据（全过程可复核）

| 步骤 | 通道 | 结果 |
|---|---|---|
| ① 开放版判定 | Unpaywall API | 4 份草稿出现的 **57 个 DOI** → 40 个有合法开放版 |
| ② 全文直取 | Europe PMC 全文 XML | **13 篇**落盘 |
| ③ 补抓 | PMC 正文页（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）／Unpaywall PDF | **24 篇**落盘（含 PNAS / JBC / NAR / Genome Res / JCM / Clin Chem）|
| ④ 预印本→已发表版 | Crossref / PubMed 标题反查 | **1 篇**落盘（bioRxiv → Clin Biochem 2020）|
| **合计** | — | **本地全文 40 篇**（覆盖 36 个 DOI，另 4 篇按 PMID/预印本登记）｜**未获全文 21 个 DOI** |

> **核心结论**：原先判定的「付费墙文献」中，**25 篇其实可以免费合法读到**——不是付费墙，是通道没用对。
> 下面第 2 节逐篇列出已回收；第 3 节是**真封闭清单**；第 4 节是非文献类缺口（买不到，只能询价/自建/委托）；第 5 节是获取模板。

## 二、已回收清单（原判「未获全文」，现已有合法开放全文）

| # | DOI | 文献（标题现查）| 期刊 / 年 | 用在 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | `10.1002/biot.202000572` | Lyophilization of premixed COVID-19 diagnostic RT-qPCR reactions enables stable long-term storage at |  2021 | D2 |
| 2 | `10.1038/nm.3519` | An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. |  2014 | D3 |
| 3 | `10.1038/s41586-020-2140-0` | Integrating genomic features for non-invasive early lung cancer detection. |  2020 | D3 |
| 4 | `10.1038/sj.embor.7400200` | Helicase-dependent isothermal DNA amplification. |  2004 | D1 |
| 5 | `10.1073/pnas.071052198` | Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication. |  2001 | D4 |
| 6 | `10.1073/pnas.0730811100` | Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. |  2003 | D1 |
| 7 | `10.1073/pnas.0910781107` | Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. |  2010 | D4 |
| 8 | `10.1073/pnas.1105422108` | Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. |  2011 | D3 |
| 9 | `10.1073/pnas.1208715109` | Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. |  2012 | D3 |
| 10 | `10.1073/pnas.1901979116` | Machine learning-assisted directed protein evolution with combinatorial libraries. |  2019 | D4 |
| 11 | `10.1073/pnas.86.2.520` | Membrane phase transitions are responsible for imbibitional damage in dry pollen. |  1989 | D2 |
| 12 | `10.1073/pnas.89.1.392` | Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. |  1992 | D1 |
| 13 | `10.1073/pnas.91.22.10747` | DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution |  1994 | D4 |
| 14 | `10.1073/pnas.92.10.4641` | Rolling replication of short DNA circles. |  1995 | D1 |
| 15 | `10.1101/gr.180501` | Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling |  2001 | D1 |
| 16 | `10.1128/jcm.39.2.485-493.2001` | Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. |  2001 | D3 |
| 17 | `10.1373/clinchem.2015.245829` | Recombinase Polymerase Amplification for Diagnostic Applications. |  2016 | D1 |
| 18 | `10.1016/j.clinbiochem.2020.06.013` | Room-temperature-storable PCR mixes for SARS-CoV-2 detection. |  2020 | D2/D4 |
| 19 | `10.1101/2021.04.15.439918` | Multi-modal engineering of  Bst  DNA polymerase for thermostability in ultra-fast LAMP reactions |  2021 | D1 |
| 20 | `10.1093/nar/24.18.3546` | PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. |  1996 | D4 |
| 21 | `10.1093/nar/20.7.1691` | Strand displacement amplification--an isothermal, in vitro DNA amplification technique. |  1992 | D4 |
| 22 | `10.1074/jbc.M503096200` | Characterization of a thermostable UvrD helicase and its participation in helicase-dependent amplifi |  2005 | — |
| 23 | `10.1038/nbt.3520` | Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. |  2016 | D3 |
| 24 | `10.1093/nar/gkn1055` | Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood a |  2009 | D3 |
| 25 | `10.1093/nar/gkn952` | Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability thro |  2009 | D3/D4 |

> 说明：上表 25 篇均已落盘至 `知识沉淀/_全文/OA/`，可直接检索引用（含数值句）。

## 三、真封闭清单（24 篇，四条合法路径）

| 优先级 | 文献 | DOI | 期刊 / 年 | 出版社 | 首选渠道 | 兜底渠道 | 单篇价量级 | 支撑结论（稿别）|
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| P0 | The ice nucleation temperature determines the primary drying rate of lyophilization for samples froz | `10.1002/jps.1039` | Journal of Pharmaceutical Sciences 2001 | Elsevier BV | 馆际互借 | 作者索取 | Wiley 单篇约 $35–50 | 冰成核温度 ↔ 一次干燥速率的定量关系（决定冻干周期设计与放大）（D2）|
| P0 | Hydrogen Bonding between Sugar and Protein Is Responsible for Inhibition of Dehydration-Induced Prot | `10.1006/abbi.1999.1175` | Archives of Biochemistry and Bioph 1999 | Elsevier BV | 馆际互借 | 作者索取 | Elsevier 旧刊单篇约 $30–45 | 「水替代」机理的奠基证据（保护剂为何有效的第一性解释）（D2）|
| P0 | Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals | `10.1016/S0378-5173(00)00423-3` | International Journal of Pharmaceu 2000 | Elsevier BV | 馆际互借 | 作者索取 | Elsevier 单篇约 $30–45 | 冻干蛋白制剂开发权威综述（配方 + 工艺 + 稳定性全套框架）（D2）|
| P0 | Effect of process conditions on recovery of protein activity after freezing and freeze-drying | `10.1016/S0939-6411(98)00007-1` | European Journal of Pharmaceutics  1998 | Elsevier BV | 馆际互借 | 作者索取 | Elsevier 旧刊单篇约 $30–45 | 冻干后酶活回收率的工艺影响因素（回收率基线原始数据）（D2）|
| P0 |  | `10.1016/j.ejpb.2017.01.024` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | Elsevier 单篇约 $30–45 | 糖类在固态与干燥过程如何保护蛋白（D2 保护剂机理综述）（D2）|
| P0 | Lyophilized Ready-to-Use Mix for the Real-Time Polymerase Chain Reaction Diagnosis | `10.1021/acsabm.1c00131` | ACS Applied Bio Materials 2021 | American Chemical Societ | 作者索取（邮件/ResearchGate） | 馆际互借 | ACS 单篇约 $35–45 | 冻干 RT-PCR 成品配方的定量数据（成品级实测：残留水分、保护剂、加速条件）（D2）|
| P0 | Trehalose Crystallization During Freeze-Drying: Implications On Lyoprotection | `10.1021/jz900338m` | The Journal of Physical Chemistry  2009 | American Chemical Societ | 馆际互借 | 作者索取 | ACS 单篇约 $35–45 | 海藻糖冻干结晶风险（保护剂失效主因，直接影响配方选择）（D2）|
| P0 | Design of Freeze-Drying Processes for Pharmaceuticals: Practical Advice | `10.1023/B:PHAM.0000016234.73023.75` | Pharmaceutical Research 2004 | Springer Science and Bus | 馆际互借 | 作者索取 | Springer 单篇约 $40–50 | 冻干工艺设计奠基性综述（降温速率、成核、一次干燥）；D2 多处结论源自其 2023 更新版引用（D2）|
| P0 |  | `10.1074/jbc.M300815200` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | JBC 免费（需正式渠道取） | 海藻糖为何是优异蛋白保护剂（热稳定性机理定量；JBC 12 个月后免费，但无 PMC 副本）（D2）|
| P0 | Protein Stability During Freezing: Separation of Stresses and Mechanisms of Protein Stabilization | `10.1080/10837450701481157` | Pharmaceutical Development and Tec 2007 | Informa UK Limited | 馆际互借 | 作者索取 | T&F 单篇约 $35–50 | 蛋白冷冻「三条失稳路径」的分离与量化（D2 失稳机理表的直接出处）（D2）|
| P0 |  | `10.1093/nar/gkn952` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | NAR 开放获取（可再试 PMC） | Kermekchiev 2009 耐抑制剂 Taq 改造（D3「耐抑制高保真酶」靶点的原始论文）（D3）|
| P1 |  | `10.1038/898` |   |  | 作者索取（邮件/ResearchGate） | 馆际互借 | Springer Nature 单篇约 $30–45 | RCA 单分子计数原始论文（Lizardi 1998，D1 RCA 路线起点）（D1）|
| P1 | Forty years of directed evolution and its continuously evolving technology toolbox: A review of the  | `10.1002/bit.28009` | Biotechnology and Bioengineering 2022 | Wiley | 作者索取（邮件/ResearchGate） | 馆际互借 | Wiley 单篇约 $35–50 | 定向进化四十年技术谱系综述（方法论总览与选型依据）（D4）|
| P1 |  | `10.1016/j.ab.2009.02.008` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | Elsevier 单篇约 $30–45 | epPCR 与核苷类似物法的突变谱/偏性定量比较（Rasila 2009）（D4）|
| P1 |  | `10.1016/j.cels.2021.07.008` |   |  | 作者索取（邮件/ResearchGate） | 馆际互借 | Cell Press 单篇约 $35–50 | MLDE 训练集设计实操（Wittmann 2021，Cell Systems）（D4）|
| P1 |  | `10.1023/a:1011987707515` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | Springer 单篇约 $30–45 | 冻干/冻融后 LDH 稳定化（回收率 80%/65% 的原始实验条件）（D4）|
| P1 | Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling | `10.1038/370389a0` | Nature 1994 | Springer Science and Bus | 馆际互借 | 作者索取 | Springer Nature 单篇约 $30–45 | DNA shuffling 原始论文（定向进化方法起点，D4 方法谱系第 1 条）（D4）|
| P1 | Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination | `10.1038/nbt0398-258` | Nature Biotechnology 1998 | Springer Science and Bus | 馆际互借 | 作者索取 | Springer Nature 单篇约 $35–45 | StEP 交错延伸重组（不依赖限制酶的重组方法，D4 方法对比表必引）（D4）|
| P1 |  | `10.1038/s41592-019-0496-6` |   |  | 作者索取（邮件/ResearchGate） | 馆际互借 | Springer Nature 单篇约 $40–50 | 机器学习辅助定向进化（Nat Methods 2019，D4 与 Wu 2019 PNAS 并列的 ML 路线）（D4）|
| P1 | Fluorescence-activated droplet sorting (FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymati | `10.1039/b902504a` | Lab on a Chip 2009 | Royal Society of Chemist | 馆际互借 | 作者索取 | RSC 单篇约 $35–50 | FADS 荧光激活液滴分选（分选速率/电极/表面活性剂配方，自建平台关键）（D4）|
| P1 |  | `10.1093/nar/28.12.e63` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | NAR 开放获取（可再试 PMC） | Cadwell & Joyce 1992 随机突变文库构建（D4 突变库方法起点）（D4）|
| P1 |  | `10.1101/gr.2.1.28` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | CSHL 单篇约 $30–45 | PCR 随机突变（Genome Res 1992，D4 早期突变方法）（D4）|
| P1 | Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase | `10.1126/science.aaf5409` | Science 2016 | American Association for | 作者索取（邮件/ResearchGate） | 馆际互借（Science 24 h 租读约 $10 量级） | Science 单篇约 $30–60 | RTX 校正型逆转录酶的合成进化起源（含保真度硬数据）（D4）|
| P1 |  | `10.2144/97232rr01` |   |  | 馆际互借 | 作者索取 | 未核实 | 枯草芽孢杆菌随机突变大文库构建（BioTechniques 1997）（D4）|

## 四、非文献类缺口（买不到，只能询价/自建/委托）

| 类别 | 缺什么 | 解决路径 | 主责 |
|---|---|---|---|
| 厂商性能数据 | 冻干酶活性回收率、12/24 个月加速稳定性（NEB / Meridian / 翌圣 / 诺唯赞 / Thermo）| 发询价函索 COA 与稳定性数据包（NDA 下）| 产品部 + 销售支持 |
| 实时价格 | 冻干全预混 / 等温扩增 OEM 目录价（多为询价制）| 5 家询价函，报价入价格库 | 销售支持 |
| 专利法律状态 | US8637253B2 / US20090017453A1 / US11186864 / US5605793 / US9487829B2 的到期日与权利要求边界 | 委托专利律所出 FTO 意见 | 法务 / 知产 |
| 主体核不实 | 纽哈勃 NHID 官方产品页（`nuhighbio.com` 与 NHID 是否同一主体）| 企查查/天眼查核主体 + 直接索取资料 | 产品部 |
| 内容空洞 | ① EDTA/胆盐抗性定向进化专门案例 ② 以冻干回收率为选择压力的定向进化 ③ <100 bp 扩增子提升 cfDNA 检出率的原始文献 | 无现成文献，属自建实验课题 | 研发（酶学组）|

## 五、获取模板

**作者索取（中/英）**：主题 `Request for reprint: <论文标题> (<期刊>, <年>)`；正文三句——自我介绍（宝锐生物 BIORI BIOTECH，IVD 原料研发）、用途（内部技术评估，不转载不商用）、请求 PDF 或接受稿。2015 年后论文命中率高；48 h 无回应再跟进一轮。

**馆际互借（ILL）**：走珠海本地高校馆或公共馆的 ILL 服务，单篇一般 3–10 个工作日、费用 0–30 元；下单需 DOI + 刊名 + 卷期页。

**单篇购买**：仅在「该篇直接支撑对外文件或专利决策」时买；Science/Nature 系可按 24 h 租读（约 $10 量级）临时替代。