# 产品问答：探针法 LAMP 是否都必须依赖 RNase H 切割？

## 问题

探针法 LAMP，还有不切割荧光基团的方案吗？难道不都是探针上有 RNA 碱基，所以需要 RNase H 切割？

## 一句话回答

不是。RNase H 切割只是探针法 LAMP 的一条路线，而且不是默认路线。LAMP 的序列特异检测可以用不切割的构象型探针、链置换探针、掺入型报告探针；只有含核糖核苷酸的 RNase H 依赖型探针才需要酶切。

## 先纠正三个容易说错的点

1. **“LAMP 探针都必须带 RNA 碱基”不成立。** RNA 碱基的作用是给 RNase HII / RNase H2 提供切割位点，不是所有探针的必要结构。
2. **“不切割方案是少数/非主流”不能这样下结论。** 染料、浊度、pH 是大量实际在用的非序列特异读出；分子信标、置换探针、QUASR、HyBeacon 等是序列特异但不切割的路线。不同产品、不同客户场景各有选择，不能按“主流/支线”二分。
3. **TaqMan 水解探针不适用于 LAMP，不等于所有切割型探针都不适用。** Bst 聚合酶缺乏 5′→3′ 外切活性，TaqMan 那套水解机制不能用；RNase HII 是外加酶，属于另一套切割机制。

## 方案谱系

| 路线 | 代表方案 | 是否切割探针 | 序列特异 | 多重 | 备注 |
|---|---|---:|---:|---:|---|
| 非序列特异 | 嵌入染料（EvaGreen、SYBR Green） | 否 | 否 | 差 | 便宜、简单；引物二聚体也发光 |
| 非序列特异 | 浊度（焦磷酸镁） | 否 | 否 | 差 | 终点/实时浊度 |
| 非序列特异 | pH / 显色指示剂 | 否 | 否 | 差 | 适合简单 POCT |
| 构象型 | 分子信标（Molecular Beacon） | 否 | 是 | 可 | 发夹打开产生荧光；LAMP 高温下需做茎长/Tm/LNA 优化 |
| 链置换型 | Assimilation / Displacement probe | 否 | 是 | 可 | 猝灭链被聚合酶置换 |
| 链置换型 | DARQ | 否 | 是 | 可 | 2012 年报道，FIP 引物 + 互补猝灭链 |
| 链置换型 | ProbeLAMP（Firebird） | 否 | 是 | 可 | 商品化方案；参数以厂家资料为准 |
| 掺入型 | QUASR | 否 | 是 | 可 | 荧光标记引物 + 短猝灭寡核苷酸；终点读数 |
| 熔解曲线型 | HyBeacon | 否 | 是 | 可 | 非延伸探针，靠熔解/退火曲线 |
| 其他 | GO-FRET、荧光环引物 + PEI 等 | 否 | 是 | 研究阶段 | 证据多在论文，未普及 |
| 酶切型 | RNase HII / RNase H2 探针 | 是 | 是 | 可 | 探针内含 RNA 碱基；商品化试剂盒常见 |
| 酶切型 | RCDP-LAMP | 是 | 是 | 可 | 2025 年 PLOS Neglected Tropical Diseases，rG 位点被 RNase HII 切割 |

## 为什么 Bst 体系里 TaqMan 式探针不适用

Bst DNA 聚合酶具有 5′→3′ 聚合活性和链置换活性，但缺乏 5′→3′ 外切活性。TaqMan 探针依赖聚合酶的 5′→3′ 外切活性水解探针，因此在 Bst LAMP 体系里不能照搬。

RNase HII 路线是另一种设计：探针内部嵌入 RNA 碱基，探针与靶标杂交形成 RNA/DNA 异源双链后，RNase HII 在 RNA 位点切割，荧光基团与猝灭基团分离。它不依赖 Bst 的外切活性。

## 选型逻辑

| 客户需求 | 优先路线 | 需要确认 |
|---|---|---|
| 只做有/无，成本优先 | 染料、浊度、pH | 是否接受非序列特异、是否单靶标 |
| 单靶标，要求序列特异 | 分子信标、置换探针、QUASR | 60–65℃ 下的探针 Tm、茎长、LNA 修饰 |
| 多靶标，一管多重 | 分子信标、置换探针、RNase HII 探针 | 仪器通道数、荧光串扰、引物互作 |
| 已有 Bst 体系，不想加大改 | 分子信标或置换探针 | 探针浓度、反应温度、聚合酶兼容性 |
| 有 RNase HII 供应/酶组合能力 | RNase HII 探针 | RNA 碱基位置、酶批次、RNase H 活性残留 |

## 业务含义

- **RNase HII 是上游原料机会，但不是唯一机会。** 切割型方案需要 RNase HII；不切割方案需要好的探针设计和高温下的信噪比。
- **多重检测是选型分水岭。** 染料类无法区分靶标；要做多重，需要序列特异探针，分子信标、置换探针、RNase HII 探针都可以，不能只说“必须上某一种”。
- **客户如果 already 有 Bst 体系**，优先看不切割的构象/置换探针，避免引入额外酶和复杂体系；客户如果有 RNase HII 酶组合能力，再谈切割型。

## 证据与待核

- NEB：Bst DNA Polymerase Large Fragment 具 5′→3′ 聚合活性，无 5′→3′ 外切活性。
- LAMP-BEAC：Sherrill-Mix et al., Genome Biology 2021，分子信标用于 RT-LAMP，支持单管多重。
- QUASR：RT-LAMP 的猝灭型报告探针，支持闭管、多重、终点检测。
- DARQ：Tanner et al., 2012，链置换型探针，支持多重 LAMP。
- ProbeLAMP：Firebird Diagnostics 商品化置换探针，具体性能以厂家资料为准。
- RCDP-LAMP：Zhang et al., PLOS Neglected Tropical Diseases 2025，RNase HII 切割 rG 位点；不是 PLOS Pathogens。
- Meridian、Yeasen 等厂商有 RNase HII/LAMP 探针相关试剂；具体探针浓度、反应时间、兼容的 Bst 版本，必须按具体产品说明书确认，不能把某一家的 0.05 μM / 25 min 当成通用参数。

## 不建议写进对外材料的句子

- “LAMP 探针都必须带 RNA 碱基。”
- “不切割方案才是主流。”
- “TaqMan 探针完全不兼容 LAMP，所以 LAMP 不能做探针法。”
- “多重 LAMP 必须用分子信标或置换探针。”
- “Bst 2.0 一定比 Bst 3.0 抗抑制性强。”