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title: Tth 体系引物探针设计参考（一步法/两步法）
scene: Tth 体系/引物探针设计/筛选
line: da
owner: 待指派
updated: 2026-11-02
confidence: 中
source: 用户提供的内部设计参考（2026-11-02）；配套证据页：资料/Tth酶体系引物探针设计建议_20261101_V01.html
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# Tth 体系引物探针设计参考

## 一步法

| RT 温度 | 引物 Tm | 探针 Tm |
|---|---|---|
| 60℃ | 60–64℃ | 68–72℃ |
| 63–65℃ | 63–66℃ | 68–72℃ |

## 两步法

- RT 可用单独的高 Tm 基因特异引物。
- PCR 引物仍可按 58–62℃ 设计。

## 水解探针

- 水解探针 Tm 通常比引物高 **8–10℃**。
- 常规 qPCR 探针 Tm 常落在 **68–70℃**。

## 与双酶体系设计原则的差异

关键不是把所有引物、探针的 Tm 统一抬高，而是让**引物与 RT/退火温度匹配**：

- 一步法：引物要跟住 RT 温度；RT 60℃ 与 63–65℃ 对应不同的引物 Tm 区间。
- 两步法：RT 引物可以单独用高 Tm 基因特异引物，PCR 引物不必跟着 RT 温度一起抬高。
- 探针仍要保持比引物高 8–10℃，并落在 68–72℃ 的工作区间。

## 筛选要求

- 本参考是设计方向，不是“按公式一次成功”的保证。
- 前期已有客户应用 Tth 体系，筛选工作量不小；重点仍在**多组引物 × 探针 × 温度条件的实测筛选**。
- 对外答复时不要把某个项目的筛选结果外推为通用设计规则；应同时给出体系、模板、仪器和筛选条件。

## 相关文件

- 证据页：`资料/Tth酶体系引物探针设计建议_20261101_V01.html`
- 客户版：`对外物料/Tth酶体系引物探针设计_客户报告_20261101_V01.docx`