---
title: CT值偏大是什么原因？
scene: 科研技术支持 · qPCR/RTQ 故障排查
line: ls
owner: 王凡(浙江)/蒋嵘(广州)
updated: 2026-09
confidence: 中
source: 科研FAQ-2026年9月.docx（科研技术支持整理，2026-09）
---

# CT值偏大是什么原因？

原因分析：

内参基因和目的基因CT值都偏大：偏向体系、抑制、试剂、模板稀释、加样问题；cDNA 存在 PCR 抑制物：反转录体系组分残留：RT‑buffer、DTT、甘油、残留蛋白、盐离子。

**cDNA 模板量不足**：①RNA降解，RNA起始量低，反转录效率差；②cDNA降解：DNase 污染，反复冻融

**内参正常，靶基因Ct偏大**：①引物扩增效率低： ②靶基因丰度低：提高模板的添加量。

建议：

做梯度稀释（5×、10×、20×），稀释后 Ct 回落 → 确认抑制；

①跑琼脂糖电泳看 RNA 完整性； ②新鲜反转录的cDNA，避免反复冻融；

需重新设计引物，保证引物扩增效率为90-110%；提高模板的添加量。

排查流程

先看同板对照

**阳性质粒对照 Ct 也偏大**：试剂、程序、仪器、加样问题。

阳性对照正常，仅 cDNA 样本 Ct 高：模板抑制 / 模板质量问题。

**内参 Ct 高，目的基因也高**：cDNA 整体质量差。

**内参正常，仅靶基因 Ct 高**：引物探针或者靶基因丰度低。

稀释验证实验

取一份 cDNA 做 1×、5×、10×、20 倍稀释跑 qPCR

**理想**：稀释 10 倍，Ct 理论上升约 3.3（2 倍效率）

**如果**：稀释 10 倍，Ct 上升＜2，说明存在 PCR 抑制。需要增大稀释倍数，减少 cDNA 上样量。

**核对 cDNA 上样体积**：qPCR 总 20 μL 体系，cDNA 建议≤2‑3 μL。

**检查水**：确认是 Nuclease‑free water，不用 DEPC 水。

**复核 qPCR 程序**：退火温度、变性时间。


---

*来源：科研FAQ-2026年9月.docx ｜ 录入 2026-09-30 ｜ 置信度：中（技术支持整理，未经逐条复核）*