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title: 反应结束无扩增曲线出现？
scene: 科研技术支持 · qPCR/RTQ 故障排查
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owner: 王凡(浙江)/蒋嵘(广州)
updated: 2026-09
confidence: 中
source: 科研FAQ-2026年9月.docx（科研技术支持整理，2026-09）
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# 反应结束无扩增曲线出现？

原因分析：

**模板**：①模板浓度过低 / 模板降解；RNA 模板：RNA 降解，反转录失败，cDNA 量几乎为 0；DNA 模板：模板丢失、稀释过度；②模板中存在 PCR 抑制物，核酸提取残留：乙醇、酚、盐离子、肝素、血红蛋白、多糖。 表现：内参基因也不起峰。

**程序**：①检查程序设置是否有进行荧光采集；②退火温度设置不准确；退火温度太高，引物完全不结合模板；③循环数是否合理；一般不少于40，但也不超过45

**引物**：①引物浓度过低；引物设计缺陷：扩增片段太长（qPCR 建议 70‑200 bp），引物二聚体极低，完全不扩增。②引物降解、探针降解：探针荧光基团淬灭，反复冻融、反复光照会失效；③探针与模板不匹配；引物结合位点突变。

注：染料法可以看溶解曲线，若只有基线、无熔解峰，说明完全没有合成产物。

**体系配制**：体系配制过程漏加或者加错；

解决方案：

①检查 RNA 电泳 / OD260/280，避免反复冻融；②用已知阳性模板做阳性对照，判断是不是模板本身质量问题；③稀释模板 2‑5 倍再 qPCR；

①两步法qPCR需要在退火延伸步骤打开荧光收集；三步法qPCR需要在延伸步骤打开荧光收集；②引物Tm值判断。③

排查实验过程有无漏加或者加错；

排查流程：

首先确认客户有无做阳性对照；是否有其他竞品试剂存在--程序--模板--引物--体系；

| 对照设置： |
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**阳性对照**：已知阳性模板 + 完整体系；

**NTC 无模板对照**：只加水，不应起峰。


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*来源：科研FAQ-2026年9月.docx ｜ 录入 2026-09-30 ｜ 置信度：中（技术支持整理，未经逐条复核）*