PCR SENSITIVITY · EVIDENCE MAP
PCR 检测体系灵敏度 从样本到阈值的证据地图
TaqMan qPCR 为主；RT-qPCR 单列一章；同时看 LOD95、扩增效率 E、Ct 与临床灵敏度。本页用于确认报告结构，不作为最终技术结论。
灵敏度是串联系统的总结果，
不是单一酶活指标。
低拷贝时，取样体积与 Poisson 分布先设下限；酶学参数决定“能否高效延伸”，配方决定“酶与底物的有效状态”，引探决定“能否特异退火并被切割”。任何一个环节的损失，都会抵消另一环节的增益。
因果链 / CAUSAL CHAIN
01
取样与模板回收每反应有效拷贝数、提取回收率、基质抑制
LOD 的统计下限[3]
02
变性 / 模板可及GC 含量、二级结构、片段完整性
引物能否找到靶点[6]
03
引物 / 探针退火Tm、ΔG、二级结构、引物二聚体
退火占据率与特异性[6]
04
聚合酶结合 / 延伸kcat/Km(dNTP)、processivity、延伸速率、活性酶比例
扩增效率 E 的核心[4][5]
05
探针切割5′核酸酶切割效率、探针可及性、链置换
每扩增子的信号产出[5]
06
信号 / 阈值背景荧光、淬灭效率、仪器增益、阈值算法
Ct 与 LOD95 的判定[1][3]
证据簇 / EVIDENCE CLUSTERS
| 簇 | 核心问题 | 代表证据（等级） | 主要缺口 |
|---|
| A |
口径与统计
LOD95、E、Ct、临床灵敏度分别回答什么？ |
MIQE；MIQE 2.0；LOD/LOQ 方法（A） |
临床灵敏度不是 LOD 的同义词 |
| B |
酶动力学与结构
哪些动力学量直接决定延伸与切割？ |
DNA 聚合酶动力学综述；TaqMan 机制研究（B*，厂商主导）；PDB 1TAU/1TAQ（A） |
同一 qPCR 条件下的突变体动力学数据少 |
| C |
配方与辅因子
游离 Mg²⁺、dNTP/Mg、离子强度如何改变有效活性？ |
PCR 优化方法学（C）；MIQE 报告框架（A） |
配方多为经验矩阵，缺普适最优值 |
| D |
引探热力学
Tm/ΔG、二级结构、扩增子长度如何影响退火与切割？ |
qPCR 引探设计综述（B）；TaqMan 机制（B*） |
过度稳定探针会降低区分度 |
| E |
体系边界
热启动、RT、样本基质与抑制剂如何改写结论？ |
PCR 抑制机制综述（A）；耐热 RT 工程（B）；热启动 Taq（B） |
不同样本基质需独立验证 |
| F |
临床灵敏度
患者阳性检出比例由什么决定？ |
诊断准确性基本定义（A） |
需临床样本与目标人群，不能由酶学推算 |
等级：A 同行评审且直接相关｜B 同行评审但间接/体系特异｜B* 厂商主导研究，需独立互证｜C 方法学/协议｜G 缺口。临床灵敏度不进入酶学因果链，单独作为诊断准确性指标处理。
正向调整 / 需有条件processivity↑ · kcat/Km(dNTP)↑ · 游离 Mg²⁺ 滴定 · Tm/ΔG 匹配 · 短扩增子 · 热启动 · 基质前处理
负向作用 / 常见反向Mg²⁺/dNTP 过量 · 高盐/甘油 · 探针过度稳定 · 引物二聚体 · 长扩增子/高 GC · 反复冻融 · 基质抑制剂
报告目录 / CONTENTS对外技术资料版 · 以客户能理解的因果链组织，不按论文罗列
00摘要：一张图看懂灵敏度
01四个口径：LOD95、E、Ct、临床灵敏度
02串联模型：从样本到阈值
03酶学：kcat/Km、processivity、延伸速率、5′核酸酶
04蛋白结构：A 家族结构域与结构–功能权衡
05配方：游离 Mg²⁺、dNTP/Mg、离子强度、添加剂
06引探：Tm/ΔG、二级结构、扩增子、探针切割
07边界：热启动、RT-qPCR、样本基质与抑制剂
08正向 / 负向调整矩阵：条件、收益、代价
09实验验证：DoE 与 LOD95 确认
10证据表、缺口清单、术语表
[1] Bustin SA, et al. MIQE guidelines. Clin Chem. 2009. DOI 10.1373/clinchem.2008.112797
[2] Bustin SA, et al. MIQE 2.0. Clin Chem. 2025. DOI 10.1093/clinchem/hvaf043
[3] Methods to determine LOD/LOQ in qPCR. Biomol Detect Quantif. 2017. DOI 10.1016/j.bdq.2017.04.001
[4] Kuznetsova AA, et al. Structural and molecular kinetic features of DNA polymerases. IJMS. 2022. DOI 10.3390/ijms23126373
[5] Cao Q, et al. Mechanism and application of Taq DNA polymerase in TaqMan qPCR. Front Bioeng Biotechnol. 2026. DOI 10.3389/fbioe.2026.1773703（Vazyme 主导）
[6] qPCR primer design revisited. Biomol Detect Quantif. 2017. DOI 10.1016/j.bdq.2017.11.001
[7] PCR: basic protocol plus troubleshooting and optimization. J Vis Exp. 2012. DOI 10.3791/3998
[8] Sidstedt M, et al. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS. Anal Bioanal Chem. 2020. DOI 10.1007/s00216-020-02490-2
[9] RCSB PDB: Taq polymerase–DNA complexes 1TAU / 1TAQ
[10] Šimundić AM. Measures of diagnostic accuracy: basic definitions. Biochem Med. 2009. PMC4975285
[11] Kuznetsova AA, et al. Thermostable reverse transcriptase for RT-PCR. Biomolecules. 2025. DOI 10.3390/biom15111507
[12] Lee SJ, et al. Direct and hot-start PCR with Taq. IJMS. 2023. DOI 10.3390/ijms241411405
