客户答疑话术：Taq 探针切割与 Mg²⁺ 浓度

靠 Taq 酶自带的 5' 端核酸酶活性，但它不是把探针从头上“啃”掉——聚合酶延伸时先被探针挡住，把探针的 5' 端推出一段游离臂，这段游离臂进入核酸酶活性口袋被切开，报告基团与淬灭基团分开就出荧光，然后循环切到探针短到挂不住为止。所以切割是“聚合 + 链置换 + 结构特异内切”三者配合，其中聚合优先。

不会更快，反而更危险。切割效率主要受 dNTP 竞争、探针 5' 游离臂长度和酶本身影响，公开文献里没有“镁离子越高切割越快”的剂量关系；镁离子偏高主要破坏退火与延伸的严格性——出非特异扩增、引物二聚体，探针在非目标序列上也被切，结果是信号看着涨了、特异性掉了。镁离子是“有最优窗口”的参数，不是越多越好。

常规体系 1–4 mM，多数落在 1.5–3 mM；标准起点 1.5 mM，基因组类复杂模板常需 2–3 mM，超过 4–5 mM 非特异风险上来了。关键一点：dNTP 按 1:1 螯合镁离子，0.2 mM each（合计 0.8 mM）大约占位 0.8 mM，所以有效的游离镁离子 = 加入量 − 被 dNTP 拿走的量，算浓度时两个参数必须一起看。

先别急着加镁，分两类看。一类是酶活真的不足（体系镁离子偏低，或 dNTP 偏高把游离镁吃掉），这类补镁或降 dNTP 有效；另一类是非特异竞争与探针设计问题（引物二聚体、探针 5' 游离臂过长或被二级结构包住），补镁只会把非特异放大。常规做法是先看扩增曲线基线与多带情况，再决定动不动镁。

我们的 Probe qPCR 预混液（含单管全预混形态）把 buffer 与镁离子一起预混进体系，交付后客户不对镁离子做单独调节——这正是免调配的价值。若客户希望游离镁离子自主可控，我们有两条路：单独供 MgCl₂（25 mM / 100 mM / 250 mM，各 1 ml/套），以及 Mg²⁺ free 版本的预混液，客户自己在体系里补镁；具体型号按客户体系体积与装机平台确认。

会。切割效率是酶的功能属性，不是体系的固定值——文献里同一批探针换不同 Taq 变体，切割效率（以切割量/产物量计）可差到 1.2 倍；反过来，缺 5' 核酸酶域的截短酶也能靠链置换做出信号，只是走另一条路。客户若从别家酶迁移过来，建议先做一次平行验证，别直接按原来的 Ct 判读。